1、三级安全柜使用时首先用遥控器开启隔离窗，窗体警报器随即响起，当窗体向上滑动到合适的工作高度时，警报声解除，即可开始工作。
2、三级安全柜内不放与本次实验无关的物品，操作前应将实验所需的全部物品移入安全柜（工作用纸，小鼠垫料等易吹起的物品不许放在生物安全柜内以免阻塞回风隔 栅），避免操作中双臂频繁穿过气幕破坏气流；并且在移入前用70%酒精擦拭表面消毒，消毒工作台面。柜内物品摆放应做到清洁区、半污染区与污染区分开，在 柜内摆放的物品应该尽量呈横向一字摆开，操作中物品取用方便，避免回风过程中造成交叉污染。物品应尽量靠后放置，但不得挡住气道口，以免干扰气流正常流动。
3、打开风机5～10分钟，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作。将双臂应该垂直地缓缓伸入安全柜内，至少静止1分钟，使柜内气流稳定后再进行操作，柜 内操作时手应该尽量平缓移动。操作中如确实需要拿出手臂或物品进入，也应垂直地缓缓进出，且可能接触感染物品，要对手套及手臂进行表面消毒；
4、避免震动原则：柜内尽量避免震动仪器（例如离心机、旋涡振荡器等）的使用，因为震动会使得积留在滤膜上的颗粒物质抖落，导致操作室内部洁净度降低，同时如 果在前操作面平衡失败还会引起安全柜对操作者的污染。如必须则放置在靠近柜内后壁1/3处，洁净的物品应放置在距离产生气溶胶器皿至少150mm外。
5、不同样品柜内移动原则：操作和移动物品时应按照从清洁区（低污染性物品）到污染区（高污染性物品）进行，以避免交叉污染。为防可能溅出的液滴，可在台面上铺一用消毒剂浸泡过的毛巾或纱布，但不能覆盖住安全柜格栅。
6、三级安全柜内操作期间，严禁使用酒精灯等明火，以避免产生的热气流干扰柜内气流稳定；且明火使用过程中产生的细小颗粒杂质将被带入滤膜区域，这些高温 杂质会损伤HEPA滤膜。无法避免一定需要使用的时候，宜使用低火苗的本生灯。允许使用微型电加热器或红外灭菌器，使用一次性无菌接种环；
7、工作时尽量减少背后人员走动以及快速开关房门，以防止安全柜内气流不稳定。
8、在实验操作时，不可打开玻璃视窗，应保证操作者脸部在工作窗口之上。操作尽量工作台中央，稀释病毒样本必须在生物安全柜中,不可吹打,在旋涡混匀器上混匀,吹打产生的气溶胶极易造成整个试验环境的污染；将盛有样品的试管或试盘的表面密封以防止下沉气流侵袭样品。
9、三级安全柜应定期进行检测与保养，以保证其正常工作。工作中一旦发现安全柜工作异常（例如持续气流报警，表明安全柜的正常气流模式受到了干扰，操作者或物品当即处于危险状态），应立即停止工作，采取相应处理措施，并通知P2管理员。
10、允许全天24小时工作。连续工作有助于控制实验室中灰尘和颗粒的水平；推荐将安全柜一直维持运行状态。工作*后，关闭玻璃窗，保持风机继续运转10～15分钟，同时打开紫外灯，照射30分钟。
11、要丢弃的、污染的物品应暂时放在安全柜的后部；操作过程中避免将要丢弃的物品放到安全柜外的容器内。包括废弃物袋、盛放废弃吸管的盘子以及吸滤瓶等体积较 大的物品，应放在某一侧不能拿出安全柜；将所有需要丢弃的物品放入黄色生物安全袋或废弃物容器内，严密封口后方可拿出；柜内使用的物品应在表面消毒后再取 出，以防止将病原微生物带出而污染环境。
12、三级安全柜应定期进行清洁消毒，柜内台面污染物可在工作完成且紫外灯消毒后用2%的84消毒液擦拭。也可用70%酒精并对工作台面、后壁、侧壁, 观察窗的内侧进行消毒；柜体外表面则应每天用1%的84消毒液擦拭。甲醛蒸汽熏蒸是清除污染常用的方法。
